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MICROBIOLOGIA VETERINARIA



55 tesis en 3 páginas: 1 | 2 | 3
  • SISTEMAS DE CAPTACION DE HIERRO EN HAEMOPHILUS PARASUIS .
    Autor: RIO GONZALEZ M. LUISA DEL.
    Año: 2003.
    Universidad: LEON.
    Centro de lectura: FACULTAD DE VETERINARIA.
    Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.
    Resumen: El hierro es un elemento esencial para la supervivencia de los seres vivos y su disponibilidad limitada en el hospedador natural conlleva a la búsqueda, por parte de los microorganismos, de sistemas eficientes de captación que constituyen potenciales factores de virulencia. Hasta la fecha, existían dudas acerca de los posibles mecanismos de captación de hierro en H.parasuis, especulándose acerca de las proteínas de unión a transferrina o a sideróforos como mecanismos potenciales de adquisición de hierro en esta especie bacteriana. Continuando con el trabajo desarrollado en nuestro laboratorio en relación a los genes que codifican para las proteínas de unión a transferrina en H.parasuis, en esta Tesis Doctoral se ha demostrado la presencia de las proteínas de unión a transferrina TbpA y TbpB en esta especie. Al igual que sucede en otra especies de la familia Pasteurellaceae, H. parasusis posee adyacentes a los genes tbpB y tbpA otros tres genes, tonB, exbD, que posiblemente intervengan en el aporte energético necesario para la captación e internalización del hierro. Los cinco genes se disponen en la misma región con un promotor que se localiza al inicio del gen tonB y que se superpone con una caja Fur implicada en la regulación del sistema de cpatación de hierro en virtud de la concentración de este elemento presente en el medio. Con el fin de caracterizar una de las proteínas receptoras de transferrina, se produjeron dos proteínas de fusión, una de ellas dirigida contra los extremos amino y carboxilo de la protena TbpB (GST-TbpB), y la otra contra el extremo N-terminal de la proteína TbpB (TbpB-His). Se estudiaron las condiciones de expresión de ambas proteínas, purificándose la construida frente al extremo N-terminal de la proteína TbpB. Se obtuvo un panel de 3 anticuerpos monoclonales frente a la proteína de fusión GST-TbpB y 11 frente a la proteína de fusión TbpB-His tras la inmunización en ratones BALB/c y posterior fusión. Dos de los anticuerpos monoclonales obtenidos frente a la proteína TbpB-His reaccionaron positivamente en ELISA frente a un extracto salino de H.parasuis. Los anticuerpos monoclonales obtenidos frente a la proteína GST-TbpB reaccionaron además de forma específica con la proteína de fusión TbpB-His, demostrándose, la inmunodominancia del extremo N-terminal de la proteína TbpB de H.parasuis. Se obtuvieron, igualmente, anticuerpos policlonales frente a la proteína GST-TbpB, que junto con los anticuerpos policlonales obtenidos en A.pleuropneumoniae frente a las proteínas TbpA. TbpB y ExbB han permitido, por una parte, demostrar la presencia de estas proteínas en todos los serotipos de H.parasuis y, por otra, conocer la regulación de su expresión en medios con limitación de hierro. Así, se ha podido demostrar que la expresión de las tres poteínas está regulada positivamente en función de la concentración de hierro del medio de cultivo, aumentando su expresión al limitarla. Se ha demostrado, por otra parte, un segundo mecanismo de cpatación de hierro en H.parasuis mediante proteínas de unión a sideróforos de tipo hidroxamato. H.parasuis es capaz de producir sideróforos en respuesta a niveles bajos de hierro en el medio de cultivo y posee además los cuatro genes que participan en la unión a sideróforos de tipo hidroxamato (fhuC, fhuD, fhuB y fhuA), localizados de forma consecutiva en la misma región del cromosoma bacteriano. Mediante un anticuerpo policlonal generado frente al receptor de membrana externo FhuA, se ha constatado que la expresión de la proteína FhuA no está regulada por lal concentración de hierro presente en el medio de cultivo, debiendo estar regulada, por otros mecanismos diferentes a los que suceden en las proteínas de unión a transferrina. H.parasuis, por tanto, posee al menos dos sistemas de captación de hierro: las proteínas de unión a transferrina TbpA y TbpB y las proteínas de unión a sideróforos de tipo hidroximato, además de producir sideróforos in vitro. Estos mecanismos de cpatación de hierro, debido a la baja disponibilidad del elemento, son probablemente decisivos para su virulencia y para el desencadenamiento de enfermedad en el hospedador natural. Las predicciones de la estructura secundaria de las proteínas que intervienen en la captación de hierro mediada por proteínas de unión a transferrina y a sideróforos de tipo hidroxamato pueden seru un antecedente para la búsqueda de regiones funcionales diana para estudios posteriores de inactivación de determinados genes implicados en la captación de hierro en H. parasuis que conduzcan a una disminución en la virulencia de este microorganismo.
  • MICROBIOLOGIA DEL PESCADO DE ORIGEN MARINO. MICROORGANISMOS INDICADORES, ALTERANTES Y PATOGENOS, CON ATENCION A PLESIOMONAS SHIGELLOIDES .
    Autor: HERRERA ARIAS FANNY CONSUELO.
    Año: 2003.
    Universidad: LEON.
    Centro de lectura: FACULTAD DE VETERINARIA.
    Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA. UNIVERSIDAD DE LEON.
    Resumen: Se analizaron 50 muestras de pescado fresco de origen marino, encontrando que su calidad microbiológica no era aceptable pero sí su grado de frescura. Se lograron aislar bacterias patógenas de origen exógeno como Staphylococcus aureus y Listeria monocytogenes; de origen acuático se aislaron cepas de Aeromonas spp., Vibrio parahaemolyticus, Edwardsiella tarda y Plesiomonas shigelloides. Esta última bacteria se tipificó mediante técnicas moleculares como fueron, la electroforesis en gel de poliacrilamida, RAPD, PCR-RFLP, obteniendo gran heterogeneidad entre las diferentes cepas; también, se realizó la secuenciación del gen RNAr 16S, encontrando que algunas cepas de P. shigelloides poseían más identidad con cepas pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae. Se logró detectar actividad hemolítica en las cepas estudiadas tanto extracelular como asociada a las células. Se observó que estas cepas toleraban hasta 5.5% de NaCl, pH entre 4.5 a 9, crecían a valores mínimos de aw de 0.92 y su temperatura mínima de crecimiento fue de 10ºC. Finalmente se logró diseñar una técnica de PCR, basada en la amplificación del gen hugA, para la identificación de esta bacteria a partir de muestras de pescado.
  • MICROBIOLOGÍA DEL PESCADO, CON ESPECIAL ATENCIÓN A AEROMONAS Y PLESIOMONAS .
    Autor: GONZÁLEZ RODRÍGUEZ M. NIEVES.
    Año: 2003.
    Universidad: LEON.
    Centro de lectura: FACULTAD DE VETERINARIA.
    Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA. UNIVERSIDAD DE LEÓN.
    Resumen: Se analizaron 12 lotes de filetes de trucha fresca y 10 lotes de rodajes de salmón fresco, estudiando la evolución del grado de frescura a lo largo del almacenamiento a refrigeración. Se concluyó que los filetes de trucha mostraban signos evidentes de alteración a los 7 días del almacenamiento y las rodajas de salmón a los 4 días; en ambos casos, los recuentos de microorganismos totales eran superiores a 8 log ufc/g. Solamente se detectó la presencia de una bacteria patógena, listeria monocytogenes, en un lote de filetes de trucha tras cuatro días de almacenamiento, confirmándose también la identidad de 140 cepas del género Aeromonas, con una elevada incidencia de cepas pertenecientes a grupos de hibridación potencialmente patógenos. También se estudiaron 24 lotes de trucha ahumada y 30 lotes de salmón ahumado, realizando el muestreo dos semanas de alcanzar la fecha de caducidad indicada en el envase. La calidad organoléptica y microbiológica de las muestras de ahumados fue aceptable en todos los casos. Por otra parte, se estudio la actividad hemolítica y proteolítica de dos cepas de aeromonas aisladas de muestras de pescado y que presentaban enterotoxicidad en modelos animales. Estas cepas se podían multiplicar activamente en extracto de pescado. Sin embargo, la expresión de su actividad hemolítica se veía inhbida por las bajas temperaturas, mientras que la producción de proteasas estaba favorecida por el crecimiento en extracto de pescado a temperaturas mesófilas. El estudio de la actividad hemolítica de cepas de plesiomonas shigelloides aisladas de pescado y otras muestras relacionadas indicó que estas cepas producen, al menos, dos factores hemolíticos, cuya expresión depende de las condiciones del cultivo y cuya detección se ve afectada por la técnica utilizada. Finalmente se ha desarrollado una técnica de PCR para la detección de cepas de Aeromonas potencialmente patógenas (portadoras de los genes aerA y hlyA) en muestras de pescado, que permite detectar niveles bajos de estas bacterias.
  • ANÁLISIS GENÓMICO Y PROTEÓMICO DE LOS MECANISMOS DE CAPTACIÓN DE HIERRO EN AEROMONAS MESÓFILAS .
    Autor: URGELL URPI CECILIA.
    Año: 2003.
    Universidad: BARCELONA.
    Centro de lectura: BIOLOGÍA.
    Centro de realización: FACULTAD BIOLOGÍA (UNIVERSIDAD DE BARCELONA).
    Resumen: El objetivo central de la presente tesis doctoral fue la caracterización de los mecanismos de captación de hierro de Aeromonas mesófilas, así como la determinaciáon de la contribución de dichos sistemas a la virulencia. Los bioensayos con las cepas indicadoras A.hydrophila SB22 (mutante amoA) y E.coli AN346 (mutante entA), nos permitieron identificar de forma presuntiva el sideróforo secretado por las diferentes cepas de Aeromonas spp.; generalmente amonabactina o enterobactina. El siguiente paso fue la obtención de un banco de mutantes por la inserción del elemento de transposición mini: Tn5-Km en un derivado rifampicina resistente de la cepa A.hydrophila AH-3. Los mutantes AH-768 y AH-777 mostraron un aumento notable de los niveles de producción de sideróforos, una disrupción de la capacidad de crecimiento en presencia de agente quelante y una discapacidad de utilización de la amonabactina y de la enterobactina como fuente de hierro. Estas alteraciones fueron relacionadas en el caso del mutante AH-768 con la carencia de una IROMP de 70 kDa de M.P., aparente y con un fenotipo atenuado en su virulencia. Los estudios de inmunodetección empleando antisuero específico contra la proteína FapA, nos permitieron detectar una IROMP en las cepas de Aeromonas productoras de amonabactina, y en algunas cepas de Aeromonas productoras de un sideróforo que no es amonabactina ni entrobactina. Pero en ningún caso se observó reacción alguna con las IROMP de las cepas de Aeromonas productoras de enterobactina. La determinación del punto de inserción del transposón en el cromosoma de los mutantes AH-768 (fapA) y AH-777 (fapG), permitió obtener la secuencia nucleotídica de la agrupación génica relacionada con la captación de hierro de elevada afinidad en A.hydrophila AH-3. Dicha agrupación génica consta de quince genes entre los cuales se localizan genes que codifican para la biosíntesis del ácido dihidroxidobenzoico (genes amlABC), genes que codifican para una sintetasa de péptidos no ribosomales (genes amlDEFGHB), para un receptor de ferri-sideróforos de membrana externa (denominado fapA), para un sistema transportador ABC dependiente de proteína periplasmática (genes fapBDGC) y para un putativo componente del sistema de secreción de sideróforos (gen mrp). Se observó una relación entre la presencia de los genes amlF, amlH y fapA y el sistema de captación de hierro en cepas de Aeromonas mesófilas cuyo sideróforo había sido caracterizado como amonabactina mediante la técnica del bioensayo.
  • VACUNAS INACTIVADAS FRENTE AL ABORTO ENZOÓTICO DE LOS PEQUEÑOS RUMIANTES (AERP): ANÁLISIS DE LA PROTECCIÓN INDUCIDA POR VACUNAS COMERCIALES Y DE NUEVO DISEÑO EN UN MODELO OVINO .
    Autor: GARCÍA DE LA FUENTE JOSÉ NORBERTO.
    Año: 2003.
    Universidad: LEON.
    Centro de lectura: VETERINARIA.
    Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.
    Resumen: Se evaluó en un modelo ovino la protección conferida por dos de las vacunas inactividades comerciales en España frente al AERP, una de ellas elaborada con clamidias producidas en saco vitelino de embrión de pollo y la otra con clamidias producidas en cultivo celular. Los parámetros analizados para evaluar su capacidad protectora fueron la temperatura rectal durante el desafío, la aparición de abortos o corderos débiles, el rendimiento cárnico de las crías, la excreción post-parto de clamidias y el seguimiento de la cinética de anticuerpos. Los datos obtenidos sugieren que las vacunas analizadas, aunque proporcionan una ligera protección frente a los abortos, no evitan la eliminación de clamidias después del parto (fuente importante de contaminación para otros animales). En la segunda experiencia se valoró, también sobre el hospedador natural, el comportamiento de dos vacunas experimentales elaboradas con clamidias parcialmente purificadas, inactivadas con BEI y adyuvadas, una con Montanide 773 y otra con QS21 (valoradas previamente en un modelo murino con resultados muy favorables), y una de las vacunas comerciales de la primera experiencia. Para evaluar la protección inducida por las vacunas se recurrió a los mismos parámetros de la primera experiencia, aunque para el seguimiento de la eliminación de clamidias se analizaron placentas, fetos y secreciones vaginales. De los resultados obtenidos se puede concluir que la vacuna comercial valorada de nuevo, pese a mejorar su eficacia protectora frente al AEPR, continúa sein evitar la eliminación de clamidias después del parto. Destacar que, al menos con la vacuna experimental adyuvada con Montanide 773, los resultados fueron bastante esperanzadores, al evitar la aparición de abortos, incrementarse los rendimientos en el peso de las crías e impedir la eliminación de clamidias en las placentas y secreciones vaginales, evitándose la contaminación del ambiente yla posible transmisión a otros animales del rebaño.
  • ESTUDIO Y CARACTERIZACIÓN DE AISLADOS DE ENTEROCOCCUS SPP OBTENIDOS DE AVES SILVESTRES .
    Autor: BALLESTEROS TERCERO CRISTINA.
    Año: 2003.
    Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
    Centro de lectura: VETERINARIA.
    Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.
    Resumen: Este estudio se ha centrado en describir las especies de enterococos presentes en el intestino de las especies analizadas y las posibles relaciones entre éstas y las características del ave (área de alimentación, tipo de dieta, carácter migratorio o sendentario, ..), así como determinar su perfil de resistencia frente a nueve antimicrobianos: penicilina, amoxicilina, trimetoprim, gentamicina, eritromicina, ciprofloxacina, bacitracina, virginiamicina y con especial interés frente a vancomicina. Se han analizado 511 individuos pertenecientes a 41 especies de aves distintas, aislándose diez especies diferentes de enterococos. E.faecalis fue aislado en el 77,1% de los individuos, E.faecium en el 13,3%, E.hirae en el 6,65, E.avium en el 6%, y el resto de los aislados (E.casseliflavus, E.durans, E.gallinarum, E.moraviensis, E.mundtii y E.raffinosus) se presentaron de forma esporádica. La composición y diversidad de especies de entrococos en las heces de aves silvestres parece depender sobre todo de la alimentación y condiciones del ambiente en el que se desarrolla el ciclo vital del hospedador. Así, los animales en estado cautivo o de hábitats periurbanos o que presentan una dieta oportunista son los que presentan una mayor diversidad de enterococcos. Por el contrario, cuando existe una especialización en un alimento y/o habitan en ambientes con menor influencia de la actividad humana se encuentra una menor diversidad de enterococos. Para determinar las posibles relaciones genéticas entre los aislados se empleó la técnica de PFGE en aislados de las especies E.faecalls y E.faecium. En ambas especies se encontró una gran variedad genética. Los aislados de E.faecalis formaban genogrupos según la especie de hospedador de origen. Asimismo, en aquellas especies coloniales, que en el estudio corresponden a las especies Pingüino de Magallanes (Spheniscus magellanicus) y Cernícalo Primilla (Falco naumanní), donde se producen una elevada densidad de animales en época de cría, se encontró la existencia de un patrón de restricción mayoritario, que se presentaba en un tercio de los aislados obtenidos, lo que prueba la existencia de una asociación entre ciertos enterococos y la especie de hospedador. La presencia de resistencias a los antimicrobianos en muchas especies bacterianas en un hecho constatado a nivel mundial. Los enterococos constituyen un género de bacterias destacado en este sentido por su capacidad para adquirir resitencias a diversas sustancias, entre las que se encuentran tetraciclinas, eritromicina, cloranfenicol, trimetoprim, aminoglicósidos, penicilinas y glicopéptidos. Sin duda, es la resistencia a glicopéptidos, concretamente a la vancomicina, uno de los fenómenos que ha desperatado mayor preocupación en Medicina humana por sus implicaciones terapeúticas. El porcentaje de aisaldos resistentes a los antimicrobianos mediante la prueba de difusión en agar fue: 5,8% frente a penicilina, 0,6 frente a amoxicilina, 2,1% a vancomicina, 20,2% a bacitracina, 66,8% frente a gentamicina, 29% frente a eritromicina, 74,4% frente a virginiamicina, 13,5% frente a ciprofloxacina, y 5,2% frente a trimetoprim. Por especie de enterococo, los porcentajes más elevados de resistencia se presentaron en E.faecalis y sobre todo, en E.faecium. Los niveles de resistencia obtenidos son similares a los de otros orígenes (animales de abasto y productos derivados de éstos) lo que cuestiona eluso de esta bacteria como indicador de antibiorresistencias de forma general. Los trece aislados resistentes a vancomicina tanto por difusión en agar como por dilución (onde de la especie E.faecium y dos de la especie E.faecalis) presentaban el genotipo vanA, lo que se determinó mediante la realización de una PCR específica. Los aislados multirresistentes, entre los que estaban los resistentes a vancomincina, procedían de hospedadores mantenidos en cautividad o ligados a ambientes sinántropicos con una dieta "oportunista", lo que sugiere una relación entre la proximidad al hombre y la presentación de antibiorresistencias.
  • ESTUDIO DE LA POBLACIÓN VULPINA DE LA PROVINCIA DE SORIA COMO BIOINDICADOR SANITARIO .
    Autor: SERRANO BARRÓN JOSÉ LUIS.
    Año: 2003.
    Universidad: ALCALA.
    Centro de lectura: FACULTAD DE MEDICINA.
    Centro de realización: FACULTAD DE MEDICINA (UNIVERSIDAD DE ALCALÁ)..
    Resumen: Con el objetivo de determinar una serie de procesos infecciosos y parasitarios zoonóticos que padecen los zorros identificando su papel en la cadena epidemiológica así como su papel como bioindicador sanitario y como animal centinela en las zoonosis, se estudiaron un total de 400 zorros (Vulpes vulpes), todos ellos procedentes de la provincia de Soria, desde diciembre de 1997 hasta abril de 2000. De estos, 198 (49,5 %) fueron hembras y 202 ( 50,5 %) machos. El peso medio en las hembras fue de 4,3 Kg. y 5,2 Kg. en los machos. Estudiando el contenido de sus estómagos, se identificaron los siguientes materiales: carroña de ovino 14,7 %, micromamíferos 48,2 %, lagomorfos 4,5 %, aves 7,7 %, otra carroña 14,7 %, vegetales 37,7 invertebrados 13,1 %, otros 2,5 %. Cestodos encontrados: Echinococeus sp. 0%, Dipylidium caninum 1,7 %, Mesocestoides sp. 65,0 %. Ascáridos: Toxocara canis 2,5 %, Ancylostoma caninum 12,2 %, Spirocerca lupi 4,7 %, Tñchinella britovi 15,2 %, Trichinella spiralis 0,2 %, Especies de pulgas: Pullex irritans 67,2 %, Ctenocephalides canis 16,1 %, Spilopsillus cuniculi 2,2 %, Ctenocephalides felis 2,2 %, Myoxopsilla láverani 2,2%, Chaetopsilla matina 0. 7 %, Chaetopsilla tticosa 5,7 %, Nosopsyllus fasciatus 1,1 %, Paraceras melis 1,1%, Ctenocephtalmus andorrensis 0,7 %, Typhloceras poppei 0,7 %, Archaeopsylla erinacei maura 0,7 %, Odontopsyllus quirosi 2,2 %. Especies de garrapatas: lxodes canisuga 5 %, lxodes hexagonus 2,7 %, Rhipicephalus sanguineus 3,5 %, Ixodes ricinus 4,2 %, Dermacentor marginatus 0,25 %, Rhipicephalus pusillus 0,2 %, Dermacentor reticulatus 0,2 %, Ácaros: Sarcoptes scabiei 5,2 %, Neotrombicula auturnnalis 1,5 %, Cheyletiella yasguri 0,5 %. Moscas rnordedoras: Hippobosca equina 1 %, Hippobosca capensis 0,2 %, Stomoxys calcvtrans 0,2 %. Leishmaniasis: 12 %, identificando el zimodema ZM-1 de Leishmañia infantum en uno de ellos. Anticuerpos frente a Brucella sp: 6,7 %. Anticuerpos frente a Francisella tillarensis: 4,5 %. Anticuerpos frente a Borrelia burgdorferi: 8,3 %. Anticuerpos frente a Rickettsia typhi: 1,2 % y 6,7 % frente a Rickettsia slovaca. No se encontraron lesiones tuberculosas en ninguno de los animales investigados. Se identificó un caso de actinomicosis. Dermatofitosis: Mierosporum canis 0,5 %, Ttichophyton mentagrophytes 0,2 %. Anticuerpos frente a Hantavirus (Puuniala y Seoul): 2,75 %. Anticuerpos frente al virus de coriomeningitis linfocitaria: 2,3 %. Estos resultados indican que el zorro es portador de numerosos procesos infecciosos y parasitarios algunos de ellos con una importante repercusión en salud pública. Demostrando el papel epidemiológico de este animal pudiendo considerarlo como un buen bioindicador y centinela.
  • CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA Y GENOTÍPICA DE POBLACIONES DE ENTEROCOCOS OBTENIDAS DE ANIMALES DE ABASTO, DE COMPAÑÍA, SALVAJES Y DEL MEDIO AMBIENTE, CON ESPECIAL REFERENCIA A LA RESISTENCIA A VANCOMICINA .
    Autor: HERRERO REDONDO INMACULADA ANGELES.
    Año: 2003.
    Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
    Centro de lectura: VETERINARIA.
    Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA DE MADRID.
    Resumen: La era moderna del tratamiento quimioterápico de las enfermedades infecciosas comenzó con el uso clínico de las sulfamidas en medicina humana en el año 1936. Desde los años 50 y paralelamente al desarrollo del uso de antibióticos para el control de las enfermedades bacterianas en el hombre, estas sustancias fueron también dirigidas hacia el campo veterinario para controlar las enfermedades de dicha etiología que afectaban a los animales. Algunos de estas sustancias se utilizaron como promotoras del crecimiento en animales de producción con los objetivos de incrementar el índice de ganancia de peso y así reducir proporcionalmente la ración de alimento. Sin embargo, la rápida aparición y dispersión de cepas bacterianas resistentes a muchos de los antibióticos disponibles ha suscitado una gran alarma social, lo que ha llevado incluso a cuestionar la utilización de antimicrobianos en animales. Uno de los géneros bacterianos que destaca por su habilidad para desarrollar resitencias a un elevado número de antimicrobianos y de transmitirla a otras bacterianas es el género Enterococcus y dentro de este género principalmente la especie E.faecium. Además de copmo microorganismo indicador de contaminación fecal, probiótico, o cultivo iniciador en la industria alimentaria, esta especie se incluye habitualmente en los programas de vigilancia de resistencias antimicrobianas. Con el objetivo prioritario de conocer el estatus de resistencias en enterococos, y especialmente a vancomicina en E. Faecium, se estudió su presencia en muestras de animales de compañías (perros), de abasto (aves y cerdos), salvajes (ciervos) y en el medio ambiente (aguas residuales). Para el aislamiento de los enterococos presentes en los diferentes tipos de muestras se utilizaron tanto siembra directa como enriquecimiento en medios selectivos con y sin vancomicina. La identificación de especie se consiguió mediante pruebas bioquimicas y la determinación del perfil de sensibilidad antimicrobiana de los aislados de E.faecium se hizo mediante la técnica de microdilución en placa. La detección de los determinantes de resistencia a vancomicina (genes vanA, vanB, vanC1 y van C2/3) se realizó aplicando una técnica de PCR múltiple seguida de electroforesis de los fragmentos de restricción y la caracterización genética de las diferentes poblaciones de E.faecium se investigó aplicando la técnica de PFGE. La presencia de enterococos fue detectada con una frecuencia elevada, próxima al 100% llegándose a identificar hasta ocho especies diferentes E.faecalis fue la especie mayoritariamente en aves y en cerdos. En los ciervos la proporción de aislados pigmentados fue muy alta e igual a la de E.faecium y E.hirae, con predominio de las especies intrínsecamente resitentes a vancomicina, probablemente reflejo de las diferencias en hábitat y alimentación de estos animales. La frecuencia más elevada de muestras con VRE correspondió a las aguas residuales con un 96% de muestras positivas. En los animales las frecuencias más altas correspondieron a las aves (33,4% y 50%) según el programa, seguidas por los perros (15%) y los cerdos (7,7% y 7,9%), mientras que no se obtuvo ningún aislado de estas características de los ciervos salvajes. La especie VRE mayoritaria en en todas las muestras fue E.faecium aunque también se obtuvieron aislados VRE identificados como E.faecalis, E.durans, E.hirae y E.avium, así como las especies intrínsecamente resistentes E.gallinarum y E.casseliflavus. La resistencia a vancomicinas en los aislados VREF estuvo siempre por el gen vanA.
  • VARIABILIDAD ADAPTATIVA Y PATOGÉNICA EN NEOSPORA CANINUM .
    Autor: PÉREZ ZABALLOS FRANCISCO JOSE.
    Año: 2003.
    Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
    Centro de lectura: VETERINARIA.
    Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.
    Resumen: En el primer experimento de esta tesis doctoral, se ha comporado la adaptación de tres aislados de N.caninum (NC-1, NC-SweB1 y NC-Liverpool) a nuevos ambientes, cultivando al parásito en una nueva línea celular, usando un modelo experimental similar al propuesto por Travisano et al. (Science, 267:87-90, 1995), para estudiar el papel de la adaptación en las poblaciones de bacterias en el laboratorio. En nuestro experimento, el parámetro maltusiano de fitness se determinó en casa aislado, midiendo la multiplicación asexual, en 10 réplicas diferentes, de taquizoítos de cada uno de los aislados antes y después de realizar 38 pases en la línea celular Marc-145. Los resultados de la prueba de evolución mostraron un incremento significativo de la media (M250 mayor M0) para los tres aislados de N.caninum (p menor 0,001). Los resultados de la prueba de diversidad genética revelaron diferencias significativas del fitness entre los tres cultivos clonales de N.caninum en t=0 y t=250. En contraste con las clásicas predicciones del trinquete de Muller, los valores del fitness obtenidos para los tres aislados mostraron rápidos cambios adaptativos. Todo ello, apoya la idea de que la propagación asexual de N.caninum de modo vertical por la vía trasnplacentaria en la naturaleza, u otras alternativas de transmisión horizonal. Todas las evidencias de nuestro estudio confirman que la estructura de población clonal debe ser mantenida como posible base de las poblaciones de Neospora. En el segundo experimento, los objetivos fueron comparar la patogenicidad, durante las fases aguda y crónica de la neosporosis, de tres aislados de N.caninum en un modelo de ratón, antes (t=0) y después (t=250) del paso del parásito por el cultivo celular durante aproximadamente 250 generaciones. Para ello, 15 ratones hembra BALB/c fueron inoculados con 5x10 6 taquizoítos de cada aislado y pase (t=0 y t=250) por cultivo celular o solo con PBS (nueve grupos de ratones en total). La mortalidad y los signos clínicos de enfermedad (erizamiento del peolo, inmovilidad, torneo y debilidad del tercio posterior y parálisis), se recogieron diariamente durante todo el periodo experimental. Se sacrificaron tres ratones de cada grupo en los día , 1,7,14,21 y 42 p.i., de los que se extrajo sangre y se procedió a la recogida de muestras de los diversos órganos diana. Las muestras de suero se alicuotaron y se guardaron a -80ºC hasta la determinación de la IgG anti-N.caninum por IFI. Distintos órganos fueron fijados en formol al 10% y procesads utilizando técnicas histológicas de rutina o se guardaron a -80ºC hasta ser procesadas para la cuantificación del ADN de N.caninum mediante PCR-cuantitaiva. La mortalidad y la morbilidad fueron significativamente mayores en NC-Liverpool que en los otros dos aislados. Los resultados han demostrado diferencias significativas entre la patogenicidad de tres aislados de N.caninum y las ausencia de atenuación del parásito tras el pase continuado en cultivo celular.
  • ESTUDIO DE LA FRECUENCIA DE DETECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE AISLADOS DE SALMONELLA SPP. OBTENIDOS DE REPTILES Y ANFIBIOS .
    Autor: TÉLLEZ PEÑA SONIA.
    Año: 2002.
    Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
    Centro de lectura: VETERINARIA.
    Centro de realización: DEPARTAMENTO PATOLOGÍA ANIMAL (FAC. VETERINARIA).
    Resumen: Desde la década de los años 70, se conoce la importancia de los reptiles y anfibios como reservorios naturales de Salmonella spp., y su acción como posibles transmisores de esta bacteria al hombre. En nuestro estudio se realizó una investigación de la frecuencia de aislamiento de bacterias pertenecientes al género Salmonella a partir de muestras fecales o cloacales de individuos asintomáticos pertenecientes de reptiles y anfibios, tanto cuativos como de vida libre, así como la tipificación y caracterización de los aislados obtenidos. El muestreo se realizó por conveniencia y de forma secuencia. Los tipos de muestra elegidos fueron hisopos de cloaca o heces. A lo largo del estudio se analizaron 597 muestras fecales o cloacales de 412 individuos, incluidos en 128 especies distintas de anfibios (n=95) y reptiles (n=317). El protocolo de aislamiento utilizado consistió en un preenriquecimiento en un caldo general, enriquecimientos selectivos y asilamiento en medios selectivos y diferenciales. Una vez confirmada la pertenencia de los aislados al género Salmonella mediante identificación bioquímica (API 20 E) y molecular (PCR), se procedeía a su serotipificación. En animales cautivos se analizaron hasta un máximo de tres muestras por animal. De los ejemplares cautivos estudiados, un 64,63% resultó positivo al análisis. La frecuencia hallada en reptiles (66,81%) fue significativamente superior a la obtenida en anfibios (43,47%). Dentro de la clase Reptilia, saurios y ofidios fueron los que presentaron una frecuencia de detección superior, 75,00% y 86,59% respectivamente. En quelonios se obtuvo una frecuencia del 22,00% y en crocondilianos del 37,50%. En los ejemplares procedentes de vida libre, de los que sólo se tuvo acceso a una única muestra, el 41,48% de los reptiles (n=94) resultaron positivos al análisis, mientras que no se obtuvo ningún aislado en las muestras de los anfibios estudiados (n=72). Dentro de la clase Reptila, los ofidios presentaron una mayor frecuencia de aislamiento (54,28%). De saurios y quelonios, se obtuvieron porcentajes similares, 36,36% y 32,43% respectivamente. Al comparar las frecuencias obtenidas en ambas poblaciones, cautivas y salvajes, las túnicas diferencias significativas que se aprecian fueron las existentes entre anfibios y saurios de ambos grupos; tanto los anfibios como los saurios cautivos presentaron frecuencias de aislamiento superiores a sus congéneres de vida libre. Entre los 244 aislados de Salmonella spp., obtenidos, la especie más prevalente ha sido S.enterica (98,36%) frente a S.bongori (0,41%). Dentro de las subespecies de S.enterica las mayoritarias han sido la I (43,85%) y la IIIb (38,96%). El resto de las subespecies han aparecido con muchas menor frecuencia. Sin embargo, en nuestro estudio no hemos hallado, ningún aislado pertenecientes a la subespecie VI de Salmonella enterica (subsp.indica). Se ha observado una gran heterogeneidad en cuanto a las serovariedades halladas, lo que indica la inexistencia de un serotipo mayoritario asociado a estos grupos zoológicos. Los 244 aislados se agruparon en 112 serotipos distintos, cuya frecuencia de presentación fue siempre inferior al 6%. Este conjunto de serotipos se agruparon en 29 grupos somáticos, de los que el C (O:6,8 y O: 6,7) fue el hallado con mayor frecuencia (17,2%). Los serotipos con mayor frecuencia de detección han sido 18:1, v:z (IIIb), Newport, 47:k:z35 (IIIb) y 47:r:z53 (IIIb), con más de 8 aislados cada uno. En el 21,8% de los reptiles positivos se ha detectado la presencia simultánea de diferentes aislados en una misma muestra, lo que corrobora el hecho de que estos animales excretan múltiples serotipos. Sin embargo, en anfibios este fenómeno no ha sido observado. La caracterización de los aislados mediante la técnica de PFGE confirma la gran diversidad genética hallada, entre y dentro de cada serotipo, no existiendo ningún clon ampliamente distribuido o asociado a una especie de hospedador concreto. Para determinar la sensibilidad antibiótica de los aislados se realizó la prueba de difusión en agar frente a un panel formado por 16 antibióticos. Confirmando lo esperado, el 91,8% de los aislados fueron sensibles a la totalidad del panel de antibióticos probado; sólo se han detectado 9 cepas (20 aislados) con resistencia a alguno de los antibióticos utilizados. La mayor tasa de resistencia se ha producido frente al ácido nalidíxido (5,32%). Por lo tanto, puede afirmarse que los perfiels de resistencia observados son compatibles con una población no sometida a presión antibiótica. Paralelamente al estudio, se analizaron muestras clínicas procedentes de reptibles y anfibios con sintomatología compatible con una salmonelosis. De este modo pudimos observar que, aunque en la mayoría de los casos, estos animales se comportan como portadores asintomáticos, en algunas ocasiones y por la actuación presumible de múltiples factores predisponentes, Salmonella spp., puede producir enfermedad en ellos. A pesar de que en España no existe descripción de salmonelosis humana relacionada el contacto con estos animales, en nuestro estudio hemos aislado seroptipos que, en otros países, han sido ampliamente asociados con diversos cuadros clínicos en el hombre.
  • INFLUENCIA DE LA CATALASA EN LA PATOGENICIDAD DE S. AUREUS Y S. AUREUS SUBSP. ANAEROBIUS .
    Autor: DÍEZ SASTRE ROSA M..
    Año: 2002.
    Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
    Centro de lectura: VETERINARIA.
    Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.
    Resumen: S.aureus es un microorganismo que en medicina veterinaria destaca por su implicación en las mamitis de hembras en lactación, lo que ocasiona grandes pérdidas económicas. Muy próximas filogenéticamente a esta bacteria se encuentra S.aureus subsp.anaerobius, el agente etiológico de la enfermedad de lso abscesos, una linfadenitis específica del ganado ovino y caprino, que afecta fundamentalmente a los animales jóvenes y que se caracteriza por la apariciciónd e abscesos en los ganglios linfáticos superificiales. A pesar de su proximidad filogenética exiten ciertas peculiaridades que diferencian a estados dos bacterias entre las que destacan su diferente patogenicidad y la ausencia de actividad catalasa por parte de S.aureus subsp.anaerobius. En una primera etapa se construyeron por recombinación homóloga de los genes katA y katB varios mutantes catalasa negativos derivados de cepas de S.aureus y un mutante catalasa positivo procedente de una cepa de S.aureus subsp.anaerobius. Posteriormente se llevaron a cabo varios estudios donde se comparó el comportamiento de los mutantes del gen kat con sus respectivas cepas parentales, con el fin de detectar alguna diferencia significativa atribuible a la catalasa. El estudio se centró en las características de crecimiento de las cepas en comparación con sus mutantes. Se concluyó que la actividad catalasa no parece afectar al ritmo de crecimiento de estas bacterias. Posteriormente se llevó a cabo un ensayo de sensibilidad al peróxido de hidrógeno in vitro. Según los resutlados obtenidos la catalasa parece actuar como un factor de protección para ambas bacterias. Sin embargo, no parece ser que el nivel de actividad expresado por cada cepa tenga relación con la sensibilidad que éstas presentan al peróxido de hidrógeno, lo que hace pensar que pudiera haber otro u otros mecanismos implicados en la eliminación de este compuesto. En los estudios realizados de supervivencia intracelular de las cepas de S.aureus en comparación con la de sus respectivos mutantes en la línea celular J774A.1 y en PMN de ovinos adultos, no se encontraron diferencias significativas atribuibles a la catalasa. En los estudios in vitro realizados sobre la capacidad de supervivencia de una cepa de S.aureus subsp.anaerobius y su mutante catalasa positivo en el interior de PMN procedentes de ovino adulto se han encontrado diferencias estadísticamente signficativas a favor de éste último. Parece, por tanto, que la restauración de la actividad catalasa proporciona a esta bacteria una mayor resistencia frente a la acción bactericida de los PMN de ovino adulto en los ensayos in vitro. En el caso de los PMN procedentes de cordero, sin embargo, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas, por lo que la catalasa no parece ejercer ninguna acción protectora. Esta discrepancia podría deberse a la importancia relativa del sistema oxígeno-dependiente utilizado por los PMN, que sería mayor enl os PMN de los animales adultos que en los de los corderos. Los estudios de la DL50 en ratones parecen indicar que la catalasa por sí misma no sería un actor decisivo, al menos en este modelo, en la virulencia de las cepas de S.aureus y S.aureus subsp. Anaerobius analizadas.
  • CARACTERIZACION GENETICA Y PAPEL EN LA PATOGENESIS DE SMCL, UNA ESFINGOMIELINASA C DE LISTERIA IVANOVII .
    Autor: GONZALEZ ZORN BRUNO.
    Año: 2001.
    Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
    Centro de lectura: VETERINARIA .
    Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.
    Resumen: El patógeno de rumiantes Listeria ivanovii se diferencia de Listeria monocytogenes en que produce una fuerte hemolisis bizonal y una caracteristica reaccion de hemolisis cooperativa (tipo CAMP) en forma de pala con Rhodococcus equi. Hemos clonado el gen responsable de las propiedades hemolíticas diferenciales de L.ivanovii,smcL, que codifica una Smasa C similar (>50% de identidad) a las esfingomielinasas C de Staphylococcus aureus (B-toxina), Bacillus cereus y Leptospira interrogans. smcL se transcribe de forma monocistrónica y su expresión es independiente de PrfA. Southern blots de baja especificidad han demostrado que, dentro del genero Listeria, smcL esta presente solamente en L.ivanovii. Hemos construido un mutante nuloen smcL. Su fenotipo en agar sangre de oveja es identico al de L.monocytogenes (i.e. Debilmente hemolítico y sin reaccion tipo CAMP con R.equi). Este mutante nulo en smcL. Su fenotipo en agar sangre de oveja es identico al de L.monocytogenes (i.e. Debilmente hemolítico y sin reaccion tipo CAMP con R.equi). Este mutante es menos virulento en el modelo murino, y su capacidad de proliferacion intracelular en las celulas epitelioides bovinas MDBK esta disminuida. Se investigó el papel de SmcL en la supervivencia intracelular utilizando un mutante de L.monocytogenes que no poseia los determinantes membranolíticos hly, plcA y plcB que es, por tanto, incapaz de proliferar en el interior de las celulas. La complementacion de este mutante con smcL en un plasmido fue suficiente para promover su multiplicacion intracelular en las celulas MDBK . Mediante microscopia electronica de trasmisión demostramos que SmcL contribuye a la disrupcion de la vacuola fagocítica y el escape de la bacteria al citoplasma celular. Por tanto, L.ivanovii posee una tercera fosfolipasa membranoactiva que, conjuntamente con PlcA y PlcB, podria actuar en concierto con la toxina formadora de poros Hly para facilitar el escape de la bacteria del compartimento vacuolar. El extremo 5´de smcL es contiguo al locus de internalinas i-inIEF, que tambien es especifico de L.ivanovii y que es requerido para la virulencia completa en el modelo murino. Por tanto, smcL forma parte de un nuevo cluster de virulencia en Listeria que es especifico de especie y que podria jugar un papel importante en el tropismo patogenico de L.ivanovii hacia los rumiantes. Una evidencia de que SmcL podria intervenir en la adaptacion hacia los rumiantes es la selectividad lítica que manifiesta hacia los eritrocitos de esto animales, que de entre todos los mamiferos son los que contienen una mayor proporcion de esfingomielina en sus membranas. Otra evidencia la proporción de esfingomielina en sus membranas. Otra evidencia la proporción experimentos de infeccion en la linea celular canina MDCK. En estas celulas, procedentes de una especie no susceptible a la infeccion por L.ivanovii, y a diferencia de lo que ocurre con celulas bovinas MDBK, la expresion de smcL no promueve la proliferacion intracelular del mutante de L.monocytogenes. Ademas de su papel mecanico en la disrupcion del fagosoma, SmcL interfiere en la via de señalizacion mediada por la ceramida. Los resultados obtenidos con mutantes isogénicos de L.ivanovii y mediante complementacion de un mutane AplcAB de L.monocytogenes demuestran que SmcL, a traves de su actividad esfingomielinasa, da lugar a la generacion de ceramida a partir de la esfingomielina presente en la membrana de la celula hospedadora. Estos analisis revelaron igualmente que la generacion de ceramida requiere la previa disrupcion del fagosoma y el escape de las bacterias hacia el citoplasma, sugiriendo que la actividad de SmcL requiere un pH neutro. En consonancia con esta observacion, mediante comparacion de secuencias hemos podido determinar que SmcL es un homologo estructural de las esfingomielinasas neutras eucariotas. Estas homologias estructurales se correlacionaron a nivel funcional con la demostracion de que SmcL tiene un pH optimo de 7,4 y que, al igual que las esfingomielinasas neutras eucariotas, su actividad es dependiente de Mg2+. Por tanto, SmcL podria mimetizar, durante la infeccion intracelular, la funcion natural de las esfingomielinasas neutras eucariotas, modulando la respuesta de la celula parasitada a traves de la interferencia con la via de señalizacion mediada por la ceramida. Uno de las respuestas celulares controladas por la ceramida es la apoptosis. L.ivanovii produce una intensa reaccion apoptotica en celulas bovinas MDBK y nuestros resultados en experimentos de infeccion con el mutante isogenico de L.ivanovii afectados en smcL y con el mutante AplcAB de L.monocytogenes complementando con smcL demuestran que la esfingomielinasa de Listeria induce apoptosis durante la infeccion intracelular. En conclusion, SmcL es un nuevo factor de virulencia de Listeria con un efecto multiple sobre la patogenesis: facilita por un lado el escape del fagosoma, por otro subvierte la respuesta celular durante la infeccion, y finalmente juega presumiblemente un papel en el tropismo patogenico hacia los rumiantes.
  • NUEVOS MÉTODOS DE INDENTIFICACIÓN Y TIPIFICACIÓN DE STANPHYLOCOCCUS.
    Autor: YUGUEROS MARCOS JAVIER.
    Año: 2001.
    Universidad: LEON.
    Centro de lectura: VETERINARIA.
    Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.
    Resumen: Los estafilococos, microorganismos ubicuos tradicionalmente considerados como patógenso oportunistas, tienen gran importancia tanto desde el punto de vista clínico por su utilización en la industria alimentaria. Staphylococcus aureus ha sido la especie más estudiada por ser un importante agente causal de infecciones nosocomiales, así como otra serie de procesos de tipo toxigénico. La necesidad de conocer los tipos más frecuentemente relacionados con estas enfermedades, así como la difusión de los mismos cuando éstas se presentan en forma de brote, son dos de las razones que han impulsado el desarrollo de nuevas metodologías que permitan tipificar los aislados de un modo sencillo y efectivo. El resto de las especies del género están cobrando cada vez más importancia desde el punto de vista clínico, bien por el mayor número de individuos dentro de las denominadas poblaciones de riesgo (ancianos, inmunodepremidos, etc.) o por el mejor conocimiento de las enfermedades que afectan a esos grupos. Debido a la amplia distribución de los estafilococos, se hacen necesarias técnicas que permitan reconcoer ante qué especie nos encontramos de un modo rápido, sencillo y certero, con el fin de valorar si se trata de un contaminante esporádico o del verdadero agente causal de la enfermedad. Nuestra propuesta se basa en la aplicación de un protocolo combinado de amplificación de un fragmento específico de ADN y su posterior digestión con endonucleasas de restricción. El polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción obtenidos, conocido comúnmente como RFLP, nos proporciona la capacidad de tipificación de cepas de Staphylococcus aureus en un caso y la posibilidad de distinguir entre 28 especies y cuatro subespecies del género Staphylococcus, para la otra secuncia nucleotídica empleada como blanco de amplificación. La utilización de secuencias relativamente conservadas (gen aroA y gen gap) nos permite identificar, tipificar, tipificar en su caso,la totalidad de aislados pertenecientes al género Staphylococcus, con independencia del origen de los mismos. El protocolo de la técnica, es sencillo, rápido ecónomico y proprociona unos resultados fáciles de interpretar, estables y reproducibles,por lo que su introducción en la rutina diaria del laboratorio de microbiología clínica puede ser una realidad en un futuro próximo.
  • ESTABLECIMIENTO DE UN SISTEMA DE VIGILANCIA VETERINARIA DE RESISTENCIA A ANTIMICROBIANOS .
    Autor: TESHAGER GETAHUN TIRUSHET.
    Año: 2001.
    Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
    Centro de lectura: VETERINARIA.
    Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.
    Resumen: Desde principios de la década de los noventa existe una gran preocupación entre las autoridades sanitarias nacionales e internacionales debido a la emergencia y diseminación de bacterias resistentes a los antimicrobianos de uso clínico. Uno de los déficit repetidamente señalados en el análisis de este problema fue la falta de sistemas de vigilancia tanto en el ámbito humano como en el animal. Por tanto el objetivo fundamental de este trabajo fue poner en marcha una red de vigilancia veterinaria de resistencias a antimicrobianos para poder disponer de datos del ámbito animal que permitan valorar su contribución al problema global de la resistencia bacteriana. Para la marcha de esta red se eligió Escherichia coli como bacteria modelo tanto para el programa de vigilancia con población animal enferma como para el programa de vigilancia con población animal sana. Como métodos para conocer la sensibilidad antimicrobiana se escogieron el de dilución en microplaca y el de difusión en agar. Al principio se estudiaron ocho antimicrobianos con el primer método y 12 con el segundo, añadiendo después otros ocho en la técnica de dilución y seis en la técnica de difusión, siendo en total 11 y 19 antimicrobianos respectivamente al final del estudio. De ellos, tetraciclina, sulfamidas, trimetoprim, cotrimoxazo, amoxicilina, amoxilicna+ácido clavulánico, cloranfenicol, ácido nalidíxico, neomicina, gentamicina, ambilacina, apramicina y florfenicol están autorizados en animales, mientras que ciprofloxacina, cefalotína, cefoxitina, cefotaxima, ceftazidima, impenem y aztreonam son principalmente de uso humano. En total hemos estudiado 1002 cepas de E.coli de origen animal en las que hemos observado distribuciones bimodales en los antimicrobianos de uso animal y unimodales en los de uso humano. Estos resultados indican que se está ejerciendo una presión selectiva elevada por el uso de antimicrobianos en los animales, lo que es preocupante desde el punto de vista de sanidad animal, ya que los porcentjaes de resistencia son altos especialmente en tetracilina, sulfamidas, trimtoprim y amoxicilina. En cambio existe una situación tranquilizadora desde el punto de vista de salud pública, ya que los niveles de resistencia son muy bajos o incluso nulos en los antimicrobianos de uso humano. También se han realizado comparaciones cuantitativas y cualitativas entre los dos métodos, observando un acuerdo generalmente muy bueno en todos lo antimicrobianos utilizados. Por tanto, la vigilancia puede hacerse tanto con los datos cuantitativos del método de dilución en microplaca como del método de difusión en agar. De hecho en la actualidad las pruebas de sensibilidad de la red de vigilancia se realizan por la técnica de dilución en 11 y por la de difusión en agar en 12 antimicrobianos. Las cepas estudiadas provienen de los dos programas de vigilancia establecidos. En el programa de animales enfermos, cuyo diseño de recogida de cepas es pasivo, se han incluido 576 cepas de diferentes especies animales procedentes de casi de todas las Comunidades Autónomas. Estas cepas fueron remitidas por los laboratorios colaboradores, cuyo número en la actualidad asciende a 24. En el programa de animales sanos se han aislado 426 cepas de heces de cerdo, procedentes de cuatro mataderos localizados en las Comunidades Autónomas de Cataluña, Galicia, Murcia y Valencia. Estas cepas porcinas se han aislado de 900 muestras recogidas en los años 1998/99 y 1999/00 (1800 muestras en total) a través de un sistema de muestreo activo. En la vigilancia de la resistencia a los antimicrobianos es importante detectar cambios precozmente y por tanto hemos establecido puntos de corte específicos que denominamos Puntos de Vigilancia Epidemiológica. Estos puntos son más restrictivos, especialmente en los antimicrobianos de uso humano que los establecidos con fines clínicos, ya que se han fijado a partir de las distribuciones poblacionales y por ello detectan cepas con bajo nivel de resitencia. Los resultados obtendios en este estudio señalan que las cepas de E.coli aisladas de animales sanos muestran en la mayoría de los antimicrobianos mayor resistencia que las aisladas de animales enfermos, lo que no coincide con los resultados obtendios en otros países. Esto puede implicar un mayor riesgo desde el punto de vista de la salud pública, ya que estos animales son destinados al consumo humano. Otro aspecto importante a la hora de evaluar la resistencia bacteriana es el del número de antimicobianos frente a los cuales es simultáneamente resitente cada cepa (resistotipos). Destaca el hecho de que son muy escasas las cepas sensibles (menor del 20%) a todos los antimicrobianos incluidos en el sistema de vigilancia, existiendo perfiles de resistencia con casi todos lo antimicrobianos empleados. Por último, el objetivo fundamental de esta red de vigilancia, que es valorar los cambios de susceptibilidad a los antimicrobianos a lo largo del tiempo, no se ha podido lograr todavía debido tanto a la corta duración del estudio como a la falta de datos de consumo de antimicrobianos en animales.
  • ENSAYOS DE DETECCIÓN DE FACTORES DE VIRULENCIA DE DERMATOPHILUS CONGOLENSIS .
    Autor: GARCÍA SÁNCHEZ ALFREDO.
    Año: 2001.
    Universidad: EXTREMADURA.
    Centro de lectura: VETERINARIA.
    Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.
    Resumen: La dermatofilosis es una epidermitis exaudativo-proliferativa con formación de costras, de carácter generalmente crónico, provocada por el actinomiceto Dermatophilus congolensis. La infección de D.congolensis tiene lugar principalmente en tejidos queratimizados, donde para su instauración necesita de enzimas capaces de degradar esta queratina. Hasta el presente trabajo, serina proteasas y fosfolipasas eran consideradas las actividades enzimáticas principalmente implicadas en la patogenia de este actionmiceto. Habiéndo sido únicamente posible, la caracterización parcial de una serina proteasas a nivel genético (Mine y Carnegie 1997). El presente trabajo ha permitido, mediante PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) con oligonucleótidos degenerados, establecer un mayor conocimiento de la secuencia de aminoácidos de la serina proteasa previamente caracterizada por Mine y Carnegie (1997), que parece estar relacionada con la familia de las subtilisinas, enzimas que en su gran mayoría son translocadas a través de la membrana como pro-enzimas, requiriendo la excisión de un pequeño segmento para pasar a la forma activa (Siezen y col., 1991), y que podría manifestar actividad queratolítica, además de proporcionar una base antigénica para el desarrollo de futuras vacunas. Igualmente este trabajo y gracias a la combinación de técnicas como RAPD (Amplificación al Azar del ADN Polimórfico) y PCR-Inverso ha permitido la caracterización genética de una ceramidasa alcalina con una homología del 30-35% a las producidas por P. Aeruginosa y M. Tuberculosis, que pensamos pueda estar implicada en la patogénesis de la dermatofilosis, y parte del gen que codifica una posible formiato acetil transferasa. Por una parte la ceramidasa podría favorecer la instauración del agente a nivel dérmico, como consecuencia de la degradación de la ceramida, así como inducir cierta modulación de la respuesta inmunológica, mientras la formiato acetil transferasa estaría relacionada con las preferencias capnofilicas del agente, favoreciendo su supervivencia en la epidermis profunda, ambiente hipóxico, incrementando además por la reacción inflamatoria. También ha sido desarrollado un PCR específico, útil para diganóstico de D.congolensis sobre material patológico (costras), mediante el diseño de dos oligonucleótidos que flanquean un segmento interno de la ceramidasa, de unos 450 pb y que se ha mostrado común a todos los aislamientos que componen nuestra colección, y no así con otras bacterias próximas a este actinomiceto. Finalmente la caracterización de genes menos relevantes, como puede ser el responsable de la síntesis de una posible óxido-reductasa, han posibilitado establecer la lata homología de las secuencias publicadas de Streptomyces coelicolor con las que hemos encontrado en D.congolensis. Este hecho, concordante con cierta proximidad taxonómica, nos permite recomendar dicho agente como referencia primaria para futuras comparaciones en estudios de caracterización genética de Dermatophilus congolensis.
  • CARACTERIZACIÓN DE LIPI-2, UNA NUEVA ISLA DE PATOGENICIDAD DE LISTERIA.
    Autor: DOMÍNGUEZ BERNAL GUSTAVO.
    Año: 2000.
    Universidad: COMPLUTENSE DE MADRID.
    Centro de lectura: VETERINARIA.
    Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA.
    Resumen: El género Listerina contiene dos especies patógenas L. Monocytogenes y L. Ivanovii. A diferencia de L. Monocytogenes, L. Ivanovii presenta, junto a otras características patogéncias difereciales, un marcado tropismo e hospedador hacia los rumiantes. En este trabajo de tesis, partiendo de unos mutantes espontáneos de L. Ivanovvi afectados en la producción de dos factores de virulencia (una esfingomielinasa y una internalina secretada), hemos identificado y caracterizado una nueva isla de patogenicidad (PAI) de Listeria. Se trata de de LIPI-2, una región cromosómica específica de L.ivanovvi, que comprende el gen de la esfingomielinasa (smcL), diez miembros de la familia multigéncia de las internalinas y una ORF de función desconocida. LIPI-2 cumple la mayoría de los criterios que definen habitualmente a las PALs: (i) gran tamaño (22 kb), (ii) presencia exclusiva en una especie que representa una patovariedad dentro del género Listeria, composición de DNA significativamente distinta a la del resto del genoma. (iii) punto de inserción asociado con un locus tRNA (iv) inestabilidad genética. LIPI-2 es la primera PAI identificada en bacterias gram-positivas para la que se demuestra inestabilidad genética y asociación con un locus tRNA, una estructura normalmente utilizada como punto de inserción de elementos genéticos móviles tales como fagos o plásmidos integrativos. El locus donde se encuentra el gen tRNA afectado por LIPI-2, enmarcado por los loci ysnB e ydel, no alberga más que una ORF enL. Monocytogenes EGDe. El análisis de la secuencia de dicha región intefénica en otras cepas y especies del género sugiere que dicho locus constituye un "punto caliente" de variabilidad genética que permite la inserción de distitnos fragmentos de DNA. La inestabilidad genética de LIPI-2 se manifiesta dando lugar a una deleción específica y reproducible que afecta a una porción de la isala así como a un fragmento de la región cromosómica adyacente. La deleción va acompañada de una pérdida de virulencia en el modelo murino y en el hospedador natural de L. Ivanovii, la oveja.En este animal, la deleción de LIPI-2 está aparentemente asociada a un cambio en el tropismo tisular. De las diez internalinas codificadas en LIPI-2 está aparentemente asociada a un cambio en el ropisimo tisular. De las diez internalinas codificadas en LIPI-2, ocho son del subgrupo S-Inl, caracerizado por su pequeño tamaño, su estricta dependencia expresional de PrfA y su crácter soluble. Las otras dos internalinas pertenecen al subgrupo L-Inl, de mayor tamaño, con dominios de anclaje a la pard bacteriana, de expresión independiente d ePrfA (o sólo paracilamente controlada), y abundantes en L. Monocytogenes. Estas dos internalinas constituyen los primeros representantes de esta clase identificadas en L. Ivanovii. LIPI-2 está presente con la misma estructura genética en todas las cepas de L. Ivanovii analizadas lo que refleja sin duda la importancia de este locus cromosómico para la biología de L. Ivanovii. Esta PAI está también insertada, en el mismo locus cromosómico, en la subespecie londoniensis, indicando que fue adquirida en un momento lejano en el tiempo, antes de la diversificación de L. Ivanovvi en las dos subramas evolutivas que la componen. La adquisición y posterior evolución de LIPI-2 ha jugado probablemente un importante papel en la definición de la especie L. Ivanovii así como en el desarrollo de su especificidad patogénica. Junto a los mutantes espontáneos de deleción de LIPI-2, hemos identificado en este trabajo otros tres mutantes estables de fenotipo débilmente hemolítico. Dos de ellos presentan defectos genéticos en el gen prfA, que codifica el regulador central de la virulencia de Listeria (prfA). Uno de los mutantes resulta de la deleción en fase de un fragmento central del gen prfA, dando lugar a una proteína funcional por pérdida del dominio de unión al DNA. El otro mutante presenta una mutación puntual que rompe la fase de lectura, dando lugar a una proteína PrfA truncada que mantiene cierta actividad residual. El análisis de este mutante revela la importancia del dominio C-terminal de cremalleras de leucina en la función transcripcional de PrfA. El tercer mutante obedece a un defecto genético desconocido, presumiblemente afectando a un locus que controla la expresión de al menos smcL y la internalina i-inlE.Todas estas mutaciones fueron obtenidas sometiendo a L. Ivanovii a condiciones de estrés asociadas conestancias prolongadas a elevada temperatura y/o fase estacionaria, reflejando el crácter dispensable de los genes de virulencia cuando la bacteria crece in vitro en el laboratorio.
  • CARACTERIZACIÓN DE CEPAS DE LISTERIA MONOCYTOGENES DE ALIMENTOS Y MUSTRAS CLÍNICAS MEDIANTE TÉCNICAS DE SUBTIPADO CONVENCIONALES Y MOLECULARES .
    Autor: AGUADO LORENZO VIRGINIA .
    Año: 2000.
    Universidad: NAVARRA.
    Centro de lectura: FARMACIA.
    Centro de realización: UNIVERSIDAD DE NAVARRA.
    Resumen: L. Monocytogenes es un microorganismo patógeno que se transmite fundamentalmente por consumo de alimentos contaminados. Es agente causal de la listeriorsis, enfermedad de baja incidencia que afecta gravemente a inmunodeprimidos, ancianos y mujeres embarazadas Se trata de un microorganismo ampliamente distribuido en el medioambiente, por lo que su presencia en alimentos es prácticamente inevitable, como hemos comprobado al aislar esta bacteria en todo tipo de alimentos presentes en el mercado. En estas circunstancias, un estudio en profundidad de los aislamientos serviría para identificar los alimentos responsables de brotes de listeriosis y detectar prácticas de riesgo que contibuyen a la diseminación de la contaminación durante la manipulación de los alimentos, lo que va a perimitr tomar las medidas de control oportunas. Para ello se han tipado mediante serotipado, fagotipado, RAPD, REA yPFGE, un total de 405 cepas aisladas de alimentos (n=375) ymuestras clínicas de pacientes con listeriosis (n=30) procedentes de la misma zona geográfica. El serotipado resulta un método poco discriminativo, ya que la mayoría de las cepas asiladas pertenecían a 4 serotipos. Sin embargo, a pesar de su escasa capacidad de discriminación, es un método indispensable para realizar uan clasificación inicial de los aislamientos que seirva como punto de partida para análisis posteriores. En el fagotipado, el elevado número de cepas notipables obtenido hizo este método poco útil para el estudio de nuestros aislamientos. Resultados mucho más satisfactorios han sido los obtenidos con los métodos de tipado molecular que han resultado altamente discriminatorios, clasificando los aislamientos en 133 subtipos. La identificación de un mismo clon en distintos alimentos de procedencia común nos ha permitido detectar contaminaciones cruzadas debidas a la manipulación de los alimentos durante su procesado.
  • PUESTA A PUNTO DE TÉCNICAS DE PCR EN HECES Y DE ELISA PARA EL DIAGNÓSTICO DE LA PARATUBERCULOSIS. ESTUDIO DE PREVALENCIA EN GANADO BOVINO .
    Autor: GARRIDO URKULLU JOSEBA MIRENA.
    Año: 2000.
    Universidad: ZARAGOZA.
    Centro de lectura: VETERINARIA.
    Centro de realización: FAC. VETERINARIA - UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA.
    Resumen: Los dos objetivos que inicialmente se plantearon en este trabajo de Tesis fueron la mejora de las técnicas de diagnóstico de la paratuberculosis en ovino y bovino y su aplicación en un estudio de prevalencia en matadero en ganado bovino. Para ello el grueso del trabajo fue dividido en tres apartados. El primero trató de mejorar el rendimiento de ELISA y de la PCR. Para la mejora de la primera técnica se partió de tres sueros-control positivos de diferente intensidad y uno negativo en la especie ovina, y de uno positivo y otro negativo en la especie bovina. Al mismo tiempo se utilizaron diferentes conjugados marcados con peroxidasa o fosfatasa alcalina forma directa o mediante enlaces intermedios. El objetivo fue encontrar la máxima diferencia entre la respuesta de los sueros control positivo y los de los negativos, lo que se denominó relación respuesta/ruido, de forma que las reacciones inespecíficas fuesen mínimas. Para ello se enfrentaron diluciones seriadas de los sueros control con diluciones de los diferentes conjugados, con lo que se determinó que la mejor relación respuesta/ruido en ganado ovino se obtenía con la dilución de suero 1/600 y el conjugado proteína G peroxidasa a una concentración de 0,025 ug/ml. El ganado vacuno la mayor diferencia entre el positivo y el negativo se obtuvo con la dilución de suero 1/200 y la proteína G peroxidasa a una concentración de 0,05 ug/ml. La mejora del rendimiento de la PCR en heces se abordó mediante la comparación de variantes en el método de concentración de las micobacterias y en la extracción del DNA. Para ello se probaron dos productos dispersantes, el dodecil sulfato sódico (SDS) y el cloruro de hexadecill piridinio (CHP), a concentraciones entre 1,25% y 20%. Posteriormente, el producto de esta concentración se trató mediante ocho protocolos experimentales para la lisis de la pared micobacteriana de tipo químico, enzimático, físico o en combinaciones. Como referencia se utilizó un protocolo de PCR basado en la concentración con Xileno y la lisis con perlas de zirconio previamente publicado (Challans y cols., 1994) (PCR-Xil). Los resultados obtenidos indicaron que con el método de referencia se obtenía mayor concentración de DNA que con cualquiera de los otros métodos. De entre los métodos analizados se seleccionó el denominado congelación-hervido (PCR-CH) fundamentado en la lisis física de las micobacterias, tras la concentración de éstas con SDS al 5%. La selección de este método se basó en la cantidad de DNA extraído, en la simplicidad de su desarrollo y en la baja toxicidad de los reactivos necesarios. El límite de detección de micobacterias de la PCR-CH se estimó en 50 micobacterias por gramo de heces. En la segunda parte de este trabajo se llevó a cabo la validación de las técnicas puestas a punto en el capítulo anterior con muestras ovinas y bovinas, y la comparación de medios de cultivo con muestras de heces ovinas. En la comparación de los medios sólo se obtuvieron aislamientos con el medio de Löwenstein-Jensen (L-J) enriquecido con micobactina J y con el medio de Middlebrook 7H11 enriquecido con OADC. El medio 7H11 fue el que proporcionó mayor número de aislamientos, menor frecuencia de contaminaciones y más fácil visualización de las colonias. También se confirmó la dependencia de Map de la micobactina en el medio L-J, pero no en M7H11. En este medio la dependencia no era del sideróforo sino del enriquecimiento con OADC. En conjunto, el aislamiento mostró una sensibilidad respecto a la calificación final de los animales del 78,1%. La validación de ELISA y de la PCR tanto en la especie ovina como en la bovina se hizo tomando los resultados de otras técnicas de forma individual o combinada como referencia. Para la validación de la PCR en la especie ovina se utilizaron la PCR-CH y la PCR-Xil. Se observó que la PCR-CH era capaz de detectar mayor número de animales exretores que la PCR-Xil. Dado que la PCR-Xil proporcionaba mayor cantidad de DNA, estos resultados se interpretaron en el sentido de que la reacción resultaba bloqueada por la copurificación de inhibidores que en el caso de la extracción por PCR-CH mantenían una relación más favorable respecto al DNA diana, de manera que la dilución del extracto bastaba para neutralizar su efecto. Los valores de sensibilidad obtenidos con la PCR-CH y con la PCR-Xil fueron del 85,2% y del 56% respectivamente, mientras que la especificidad fue del 93,3% y del 100% para cada una de las técnicas. En vista de los resultados obtenidos en la especie ovina, en ganado vacuno sólo se utilizó la PCR-CH con los que los valores de sensibilidad y especificidad fueron del 90,2% y del 97,2% respectivamente. Hay que tener en cuenta que estos resultados son relativos a otras técnicas, y que la especificidad tanto del cultivo, como de la PCR cuando se amplifica un fragmento de la secuencia IS900 es absoluta. Con la técnica ELISA se procedió de la misma forma que con la PCR. Los índices ELISA obtenidos se analizaron tomando otras técnicas de diagnóstico como referencia. La sensibilidad y especificidad observada respecto a la valoración final de los animales fue del 77,5% y del 96,9%, respectivamente cuando se tomaba el valor umbral 0,200. En ganado vacuno el valor umbral fue 0,345 y los resultados fueron sensiblemente mejores, 97,6% y 95,1% respectivamente, debido principalmente a la selección de los animales incluidos en cada grupo. En la especie ovina se incluyeron en el grupo de los positivos tanto animales incluidos en cada grupo. En la especie ovina se incluyeron en el grupo de los positivos tanto animales son sintomatología clínica como sin ella pero procedentes de explotaciones con problemas de paratuberculosis, mientras que en la especie bovina sólo se incluyeron animales con sospecha de padecer la enfermedad como positivos y de explotaciones libres de historial como negativos. En la tercera y última parte de este trabajo se realizó un estudio epidemiológico en una muestra aleatoria de 201 animales adultos sacrificados en el matadero. Sobre estos animales se realizaron las pruebas de ELISA, IDGA, PCR y cultivo de tejidos y examen histopatológico. Los valores de prevalencia fueron muy variables según se estimó una prevalencia del 19,4% y del 15,4%, respectivamente. En lo referente al cultivo los resultados fueron anormalmente bajos (prevalencia del 0,5%) teniendo en cuenta que hasta el momento se acepta que es la técnica de diagnóstico más sensible. El empleo de la histopatología en estudios epidemiológicos de matadero, con la que se observó una prevalencia del 4,7%, fue algo novedoso y sus resultados coinciden con los observados por otros autores cuando utilizaban el cultivo de tejidos como técnica de diagnóstico en estudios de este tipo. La combinación de las técnicas hizo que la prevalencia de la enfermedad se situase en el 31,3%. Este valor tan elevado se cree debido en parte a la aplicación de técnicas relativamente nuevas que mejoran la sensibilidad de las empleadas hasta la fecha.
  • INFECCIONES POR MYCOBACTERIUM SPP. EN ANIMALES SALVAJES DE LA PROVINCIA DE CÁCERES.
    Autor: TATO JIMENEZ ANGEL.
    Año: 1999.
    Universidad: EXTREMADURA.
    Centro de lectura: VETERINARIA.
    Centro de realización: FACULTAD DE VETERINARIA DE LA U.EX..
    Resumen: En esta Tesis se describe una investigación epidemiológica sobre Tuberculosis y otras micobacteriosis de animales salvajes en la provincia de Cáceres, especialmente en animales de caza, jabalíes y ciervos, en el área de la Sierra de San Pedro. Las muestras provenían fundamentalmente de las lesiones halladas en animales cazados. La micobacteria más frecuentemente aislada fue M.bovis, aunque también aislamos M.avium, M. Fortuitum, M. Smegmatis y otros. Incluímos una investigación retrospectiva sobre Tuberculosis en los cinco últimos años de campañas oficiales en el área de la Sierra de San Pedro; hemos observado como la tuberculosis ha ido incrementándose desde cero, en el año 1993 hasta el 2% en ciervos y el 8% en jabalíes, en el año 1998. Hemos relacionado la tuberculosis de animales domésticos y salvajes, en las áreas de etudio, habiendo obtenido además unos pocos aislamientos a partir de vacas. Los espoligotipos resultantes de nuestros aislamientos, ponen de manifiesto la existencia de contagios interespecíficos, entre poblaciones de animales salvajes y domésticos.
  • CONSTRUCCION Y CARACTERIZACION DE MUTANTES DE BRUCELLA SENSIBLES A LA POLIMIXINA.
    Autor: SOLA LANDA ALBERTO.
    Año: 1999.
    Universidad: NAVARRA.
    Centro de lectura: CIENCIAS.
    Centro de realización: UNIVERSIDAD DE NAVARRA.
    Resumen: La envoltura celular (EC) de Brucella presenta una serie de propiedades (incluida la resistencia a péptidos catiónicos) que hacen que pueda ser considerada como un factor de virulencia. A partir de la cepa virulenta B.abortus 2308 se construyeron mediante transposición unos mutantes, que manteniendo un lipoposacárido (LPS) de tipo liso, presentaban las propiedades de la EC alteradas. Dichos mutantes fueron más sensibles a péptidos catiónicos (polimixina B, poli-L-lisina y melitina), antibióticos y surfactantes (SDS,deoxicolato y sarkosil), y exhibieron una mayor hidrofobicidad superficial. La capacidad de invasion en células HeLa y macrofagos resultó ser significativamente menor que la de la cepa parental, y las pocas bacterias capaces de penetrar en las células eucariotas eran rápidamente destruidas. De igual modo, los estudios realizados en ratón mostraron que los mutantes eran avirulentos. El hecho de que la velocidad de crecimiento fuera similar a la de la cepa parental demuestra que los genes alterados no son esenciales para la bacteria y que estan relacionados directamente con la virulencia. El análisis genetico mostró que el transposón se localizaba en los mutantes en dos genes adyacentes (denominados bvrR y bvrS por Brucella virulence related) que forman parte de un sistema regulador de dos componentes. Este sistema presentó una homología superior al 70% con los sistemas chvI/exoS de Rhizobium meliloti y chvI/chvG de Agrobacterium tumefaciens(bacterias filogenéticamente proximas a Brucella), implicados en la virulencia y el establecimiento de la relación de la bacteria con celulas eucariotas. El análisis de los componentes de la EC mostró que los mutantes no expresaban la proteína Omp25, una de las proteinas principales de la membrana externa. Dicha proteina ha sido recientemente incluida en una familia de la que varios de sus miembros están relacionados con la invasión celular y virulencia. El analisis mediante 13C-NMR demostro que la cadena O del LPS es identica a la de la cepa parental, y con los estudios mediante HPTLC no se detectaron diferencias en el grado de fosforilación ni en el de acilación del lipido A. Sin embargo, el LPS de los mutantes une más polimixina dansilada que el de la cepa parental, lo que indica que está alterado. Por semejanza con los estudios realizados con otras bacterias, es probable que el LPS presente una diferente composición de azucares del nucleo o de acidos grasos del lípido A. Con los resultados obtenidos se puede concluir que los mutantes presentan alterado un sistema de dos compenentes( el primer sistema completo descrito en Brucella) relacionado con la virulencia y la invasión celular y que regula la expresión de la proteina Omp25 y la composición del LPS.
55 tesis en 3 páginas: 1 | 2 | 3
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